Q1：背投影针孔半径显示为橙色（缺失），怎么办？

原因：采集软件未将转盘针孔信息写入元数据（这是常态）。

解决：确认转盘型号 + 物镜倍率 → 查第 5 节速查表 → 手动输入。也可使用 SVI 在线计算器 (svi.nl/BackprojectedPinholeCalculator)。如型号不在列表中，可停盘实测或联系 SVI (svi.nl/ReportOtherMicroscope)。

Q2：我的系统有额外的中继透镜（relay lens），怎么计算？

关键原则：只有位于盘与样品面之间的放大倍率计入背投影。盘与相机之间的变倍透镜不计入针孔背投影，但需要反映在像素尺寸中。

示例：CSU-X1 + 60× 物镜 + 相机端 1.5× 中继

• 背投影针孔半径仍为 416.7 nm（1.5× 不计入）

• 像素间距 = 物理像素 / (60 × 1 × 1.5)（1.5× 计入）

Q3：同一针孔盘对不同通道使用相同针孔，参数一样吗？

是的。转盘共聚焦的物理针孔大小固定，所有通道使用相同的背投影针孔半径和间距值。但由于不同通道波长不同，同一物理针孔对应的"Airy disk 数量"不同：短波长（405 nm）→ 针孔相对更大 →

更多共聚焦外光通过；长波长（640 nm）→ 针孔相对更小 → 更好的共聚焦效果。

Q4：RI 不匹配警告（红色背景），但参数确实正确？

不要修改参数！ Huygens 的理论 PSF 会自动处理：

• 使用理论 PSF → 自动校正深度依赖的球差

• 几何畸变（Fishtank Effect）需另外校正 Z 采样间距

Q5：SNR 自动估算可靠性为 "poor"？

1. 手动估算（见 6.3 节手动估算方法）

2. 或使用经验值：转盘共聚焦一般 5–20

3. 用 Acuity 滑块微调结果锐度，不要反复改 SNR

Q6：反卷积后出现伪影？

Q7：CMLE、GMLE、QMLE 怎么选？

• 首选 CMLE：转盘共聚焦默认最佳选择

• 选 GMLE：数据极度嘈杂 + 内存充足

• 选 QMLE：时间序列/大数据量/SNR > 60 的高质量数据

注意 GMLE 内存占用远高于其他两者，宽场等大图像可能导致内存不足。

Q8：Yokogawa SoRa 如何设置？

• 在 Huygens 中选择 SoRa 显微镜类型（而非 Spinning Disk）

• Huygens 使用针对光学重分配原理优化的 PSF 模型

• 强烈建议同时使用色差校正器（Chromatic Aberration Corrector），因为 SoRa 的微透镜不消色差

Q9：我的图像严重欠采样，还能反卷积吗？

可以，但效果有限。反卷积在 PSF 尺度上工作，欠采样丢失的信息无法恢复，且可能产生混叠伪影。建议在采集时满足 Nyquist 条件。

💡 实用折中：共聚焦的理论 Nyquist 采样率非常保守（高频信息被严重衰减）。实际中使用理论值~1.5–2× 的采样间距通常可接受，但不建议超过此范围。

Q10：我的转盘系统不在速查表中？

1. 使用通用公式（见 5.9 节）自行计算

2. 停盘拍摄照明图案实测验证

3. 使用 SVI 在线计算器

4. 联系 SVI：svi.nl/ReportOtherMicroscope

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3. Moore, A.S. et al. "Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis." *Nature* 591, 659–664 (2021).

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