以下参数适用于所有类型的显微镜，包括转盘共聚焦。

像素尺寸计算

Pixel size (nm) = 物理像素尺寸 (μm) × 1000 / 总放大倍率

其中总放大倍率 = 物镜倍率 × 系统内部放大 × 中继透镜倍率，包含光路中全部放大元件（含相机端变倍透镜）。

⚠ 重要区别：像素尺寸计算需要计入全部光路放大（含相机端变倍），而背投影针孔计算只计入盘到

样品面之间的放大。两者的"放大倍率"范围不同，请勿混淆。详见 [第 4.2 节](#42-背投影针孔半径)。

✅ 详见: svi.nl/DifficultiesCalculatingThePinhole

Nyquist 采样定理

Nyquist-Shannon 采样定理要求：采样频率必须大于信号最高空间频率的两倍，才能完整捕获显微镜产生的所有信息。

⚠ 用"分辨率的 1/2"作为采样间距的经验法则不严格正确，在某些情况下会导致欠采样。理想采样率应基于系统带宽（bandwidth）定义，带宽由 PSF 决定。

✅ 详见: svi.nl/NyquistRate（"Defining the Ideal Sampling in terms of Spatial Resolution is frequently done as a rule of thumb... but this is not exactly correct"）

共聚焦/转盘共聚焦的 Nyquist 临界采样距离公式：

横向： Δx = λex / (8 × n × sinα)

轴向： Δz = λex / (4 × n × (1 − cosα))

其中：

• λex = 激发波长

• n = 透镜浸液折射率

• α = arcsin(NA / n) = 物镜半孔径角

说明：共聚焦/转盘共聚焦的 Nyquist 采样距离是宽场的一半，因为共聚焦 PSF 是激发 PSF 和探测 PSF 的乘积，系统带宽加倍。在共聚焦情况下使用激发波长（而非发射波长）计算。

✅ 详见: svi.nl/NyquistRate (EQ 4)

典型示例（60× / 1.3 NA oil, λ_ex = 488 nm, n = 1.515）：

• α = arcsin(1.3 / 1.515) = 1.03 rad

• 横向 Nyquist 距离 Δx ≈ 50 nm

• 轴向 Nyquist 距离 Δz ≈ 166 nm

💡 实用提示：SVI 提供在线 [Nyquist Calculator](https://svi.nl/NyquistCalculator) 计算您的理想采样间距。

对于 1 Airy disk 针孔，横向临界距离可增大约 50%，影响可忽略。但不建议增大轴向采样距离。

定义：

NA = n × sinα

其中 n 为透镜浸液折射率，α 为半孔径角。

NA 直接决定分辨率和 PSF 形状。由于 sinα ≤ 1，NA 总是小于浸液折射率。

常见物镜 NA 值：

⚠ 注意：当样品介质折射率 < NA 时（如用 1.4 NA oil 物镜成像水中样品），高角度光线会发生全内反射（TIR），有效 NA 被截断至样品介质的折射率。

✅ 详见: svi.nl/Numerical-Aperture

Huygens 需要两个折射率参数：

透镜浸液折射率：

✅ 详见: svi.nl/LensImmersionMedium

样品包埋介质折射率：

注意：Mowiol 的折射率取决于浓度和配方（范围 1.41–1.49）。ProLong Gold/Diamond 等固化型封片剂的折射率会随固化时间变化，仅在完全固化后才达到标称值。建议查阅产品数据手册确认。

✅ 详见: svi.nl/MediumRefractiveIndex; svi.nl/RefractiveIndex

RI 不匹配的后果

当 Lens RI ≠ Medium RI 时，会产生：

1. 球差（Spherical Aberration） — PSF 轴向拉伸、不对称；随成像深度加剧

2. 几何畸变（Fishtank Effect） — Z 方向距离被拉伸

3. 有效 NA 降低 — 全内反射截断孔径（当 Medium RI < NA 时）

Huygens 的处理方式：

• 如果在参数中正确设置了 RI 不匹配，Huygens 的理论 PSF 模型会自动计算深度依赖的 PSF 变化，在反卷积过程中自动校正球差

• 几何畸变（Fishtank Effect）需要手动校正 Z 采样间距

✅ 详见: svi.nl/RefractiveIndex; svi.nl/SphericalAberration

λ_em 设置建议：

• 带通滤片（Bandpass）：使用滤片通带的中心波长

• 长通滤片（Long-pass）：使用加权平均值，设定值应接近滤片的最小截止波长

✅ 详见: svi.nl/ExcitationWavelength; svi.nl/EmissionWavelength

常用荧光染料与激光线对照：

当在 Huygens 中将显微镜类型设置为 Nipkow (spinning disk) 时，除通用参数外，还需要设置以下转

盘特有参数：

在 Parameter Editor 中选择：Nipkow (spinning disk)

这告诉 Huygens 使用转盘共聚焦的 PSF 模型，该模型与传统共聚焦的关键区别在于：

• 考虑了针孔间距导致的信号串扰

• 考虑了多点并行激发的特性

4.2 背投影针孔半径（Back-Projected Pinhole Radius）

这是转盘共聚焦中最关键的参数之一。

这是转盘共聚焦中最关键的参数之一。

Huygens 不使用物理针孔的实际尺寸，而是使用针孔背投影到样品面上的尺寸（以半径、纳米为单位表示）。

为什么用背投影值？ 使用背投影针孔半径建立了一个统一的参考标准，避免了不同显微镜型号成像光路差异带来的复杂性。从 PSF 的角度看，重要的是针孔在样品面上的投影像，而不是这个投影是如何技术上实现的。

✅ 详见: svi.nl/BackProjectedPinholeRadius

rb = r_phys / (Mo × Msys)

其中：

• rb = 背投影针孔半径（nm）

• r_phys = 物理针孔半径（注意单位转换：若厂商给 μm 需 ×1000 转 nm）

• Mo = 物镜放大倍率

• Msys = 系统固有内部放大倍率（盘与样品面之间的固定放大）

⚠ 关键区别——什么算"放大倍率"：

| 计算项目 | 计入哪些放大 | 不计入哪些放大 |

|---------|------------|-------------|

| 背投影针孔 | 盘 ↔ 样品面之间的放大 | 盘 ↔ 相机之间的放大 |

| 像素尺寸 | 全部光路放大（含相机端） | — |

位于盘与相机之间的额外放大（如 C-mount 适配器的 1.5× 或 0.5× 中继透镜）不影响针孔在样品面上的投影，因此不计入背投影计算。但该透镜会改变像素尺寸，需要在采样间距参数中正确反映。

✅ 详见: svi.nl/BackProjectedPinholeRadius;svi.nl/DifficultiesCalculatingThePinhole

对于非圆形针孔（如方形），需进行等面积圆等效转换：

r = d / √π

其中 d 为方形针孔的边长。

✅ 详见: svi.nl/DifficultiesCalculatingThePinhole

某些共聚焦显微镜以 Airy 盘直径为单位报告针孔大小。转换公式：

rb = N_Ad × 0.61 × λex / NA

其中 N_Ad = Airy 盘数量。注意：不同厂商可能使用不同的参考波长（如 Leica 固定使用 580 nm），这会引入不确定性。对于转盘共聚焦，由于针孔大小固定且已知，建议直接用物理尺寸计算背投影值。

✅ 详见: svi.nl/BackProjectedPinholeRadius

方法一：查表法（见第 5 节速查表）

方法二：在线计算器 — svi.nl/BackprojectedPinholeCalculator

方法三：实测法（最精确）

1. 停止转盘旋转

2. 不放置样品，直接成像盘片的针孔照明图案

3. 在 Huygens Twin Slicer 中打开该图像

4. 使用鼠标光标测量针孔间距和针孔大小

✅ 详见: svi.nl/YokogawaDisk

针孔间距是转盘上相邻针孔中心到中心的距离。与针孔半径类似，Huygens 使用背投影到样品面上的间距值，单位为 μm。

✅ 详见: svi.nl/PinholeSpacing; svi.nl/PinholeDistance

db = d_phys / (Mo × Msys)

计入的放大倍率范围与背投影针孔半径完全相同（仅盘到样品面之间）。

这是 Huygens 独有的参数。针孔间距决定了相邻针孔之间的信号串扰程度：

• 间距小 → 串扰严重 → 背景升高、对比度降低

• 间距大 → 串扰小 → 但扫描效率降低

Huygens 的 PSF 模型将此串扰纳入计算，因此能更准确地恢复图像质量。其他反卷积软件不考虑此参数。

✅ 详见: svi.nl/Huygens-Spinning-Disk-Software

下期继续！！！！！